該模型的主要評價指標(biāo)為不同感染期的肺脾肝荷菌量和病變評分值，該模型與國內(nèi)外報道的經(jīng)典cornell模型類似，但是cronell模型的問題在于模型潛伏期荷菌量過高，復(fù)發(fā)期3-9個月后不等。本模型不斷的摸索嘗試克服以上問題，模型均一，參數(shù)指標(biāo)穩(wěn)定，各感染期的荷菌量值水平合適（不過低也不過高），周期明顯縮短，由3-9個月不等的周期縮短到比較穩(wěn)定的10周，便于應(yīng)用。

該模型不僅可以用于潛伏及復(fù)發(fā)的早期診斷分子的研究，還可以利用潛伏及復(fù)發(fā)期研究疾病機(jī)制，同時可以用于評價潛伏感染的預(yù)防性抗生素效果，以及治療性疫苗的效果。

動物模型的制備的設(shè)計(jì)得到研究所IACUC委員會的批準(zhǔn)，人員都是訓(xùn)練有素的研究人員和實(shí)驗(yàn)人員，全程在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，完全按照模型制備和檢測的一系列SOP操作進(jìn)行，遵守生物安全操作要求，無安全事故。

1恒河猴感染結(jié)核菌后OT實(shí)驗(yàn)

3只恒河猴感染結(jié)核分支桿菌后的第4周進(jìn)行OT試驗(yàn)，右側(cè)眼瞼明顯出現(xiàn)紅腫，存在一定程度的閉合，個體間有一定差異。舊結(jié)核菌素反應(yīng)均可判斷為陽性。

2恒河猴感染結(jié)核菌前后體重的變化

3只恒河猴感染結(jié)核分支桿菌前動物的體重都呈上升趨勢。在感染結(jié)核菌之后的前兩周相比感染前體重也有上升。但是在感染結(jié)核菌后的4周和6周動物的體重均出現(xiàn)下降。在感染后的第9周B1和C6的體重基本穩(wěn)定，C8的體重表現(xiàn)為上升。

3恒河猴感染結(jié)核菌前后體溫的變化

3只恒河猴感染結(jié)核分支桿菌之后的前兩周相比感染前體溫相對穩(wěn)定。但是在感染結(jié)核菌后的4周體溫升高，感染后第6周動物的體溫出現(xiàn)一定程度的下降，但仍高于正常體溫。在感染后的第9周C6的體溫仍較高。B1和C8的體溫降至39度以下。B1和C8目前表現(xiàn)為一過性的低熱，C6的體溫變化仍需繼續(xù)觀測。

4恒河猴感染結(jié)核菌前后血沉變化

3只恒河猴感染結(jié)核分支桿菌之后的前兩周相比感染前血沉相對穩(wěn)定。但是在感染結(jié)核菌后的4周C6的提高，感染后第6周3只猴的血沉都有一定程度的提高。在感染后的第9周B1、C6的血沉仍較高。C8的血沉降至較低水平。

5恒河猴感染結(jié)核菌前后CRP變化

3只恒河猴感染結(jié)核分支桿菌之后的前兩周相比感染前CRP相對穩(wěn)定。但是在感染結(jié)核菌后的4周、6周、9周B1、C6的CRP升高。C8的CRP在感染結(jié)核后一直維持在較低水平。

6影像學(xué)檢測結(jié)果

恒河猴C6 CT胸部影像和胸部X光檢查結(jié)果顯示其右肺中下葉存在實(shí)變影，縱隔發(fā)生右向移位，心臟偏于右側(cè)，這可能是右側(cè)肺中下葉不張引起。右肺上葉和左肺多處存在片狀實(shí)變影，散點(diǎn)狀結(jié)節(jié)影多見。根據(jù)CT和X光檢測的結(jié)果判斷有支氣管結(jié)核和肺結(jié)核的可能。

恒河猴B1 CT胸部影像和胸部X光檢查結(jié)果顯示其右肺下葉存在片狀影，縱隔發(fā)生右向移位，心臟偏于右側(cè)，這可能是右側(cè)肺下葉不張引起。肺組織偶見散點(diǎn)狀結(jié)節(jié)影。

恒河猴C8 CT胸部影像和胸部X光檢查結(jié)果顯示其右肺中下葉后段存在滲出影，CT能動態(tài)監(jiān)測右肺葉的病變, 如圖8。由于C8猴的病變較輕，因此在CT引導(dǎo)下進(jìn)行組織病理活檢，確證結(jié)核感染。

7結(jié)核抗體檢測

采用臨床人類使用的結(jié)核抗體檢測的膠體金法對感染動物的血清進(jìn)行了分析。在動物感染結(jié)核菌6周和9周時結(jié)核抗體陽性。下圖顯示6周時血清抗體檢測結(jié)果。而在感染結(jié)核菌2周和4周時結(jié)核抗體表現(xiàn)為弱陽性。值得注意的是恒河猴感染前血清檢測時也可以看到結(jié)核抗體的弱陽性。

8病理病變

大體病理：

肺組織各葉可見結(jié)核結(jié)節(jié)及滲出性病變，以右肺中下葉病變最重；肝細(xì)胞脂肪變性，肝臟內(nèi)內(nèi)可見多個結(jié)核結(jié)節(jié)；脾臟內(nèi)可見多個結(jié)核結(jié)節(jié)；腎被膜下多灶性炎細(xì)胞浸潤，可見少數(shù)結(jié)核結(jié)節(jié)；心房多灶性炎細(xì)胞浸潤（以巨噬細(xì)胞為主）；附睪內(nèi)可見結(jié)核結(jié)節(jié)；睪丸灶性壞死及炎細(xì)胞浸潤；胃粘膜炎細(xì)胞浸潤；支氣管旁淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)可見巨大結(jié)核結(jié)節(jié)；大腸、小腸、腦組織、膽囊、胰腺、腹股溝淋巴結(jié)未見明顯異常；

組織病理：

肺臟各葉可見多個結(jié)核結(jié)節(jié)，大部分結(jié)核結(jié)節(jié)中央可見干酪樣壞死，周圍類上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞圍繞，可見郎罕氏巨細(xì)胞。結(jié)核結(jié)節(jié)可融合，形成較大病灶。結(jié)核結(jié)節(jié)周圍肺泡腔內(nèi)充滿漿液性滲出物。支氣管腔內(nèi)可見粘液膿性物質(zhì)。以右肺中下葉病變最重。脾臟可見多個結(jié)核結(jié)節(jié)。部分結(jié)核結(jié)節(jié)中央可見干酪樣壞死，周圍類上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞圍繞，可見郎罕氏巨細(xì)胞。肝臟可見多個結(jié)核結(jié)節(jié)。部分結(jié)核結(jié)節(jié)中央可見干酪樣壞死，周圍類上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞圍繞，可見郎罕氏巨細(xì)胞。輕度肝細(xì)胞脂肪變性。

腎臟被膜下多灶性炎細(xì)胞浸潤，腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)破壞。腎組織內(nèi)可見少數(shù)結(jié)核結(jié)節(jié)。附睪可見結(jié)核結(jié)節(jié)，由類上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞構(gòu)成。支氣管旁淋巴結(jié)可見巨大結(jié)核結(jié)節(jié)，中央為大片干酪樣壞死區(qū)，周圍類上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞圍繞，可見郎罕氏巨細(xì)胞。肺門淋巴結(jié)可見巨大結(jié)核結(jié)節(jié)，中央為大片干酪樣壞死區(qū)，周圍類上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞圍繞，可見郎罕氏巨細(xì)胞。幽門淋巴結(jié)可見結(jié)核結(jié)節(jié)，中央為干酪樣壞死，周圍類上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞圍繞，可見郎罕氏巨細(xì)胞。

9 組織菌培養(yǎng)

猴的所有肺葉、肺門淋巴結(jié)、支氣管淋巴結(jié)的結(jié)核菌的荷菌量很高，脾、腎組織中中等水平荷菌量，肝、附睪、腹股溝淋巴結(jié)的荷菌量很低。其它組織的菌培養(yǎng)為陰性。在觀察期間肺組織的活檢培養(yǎng)為陽性。

3.1動物的選擇

3周歲以上的健康中國產(chǎn)恒河猴作為實(shí)驗(yàn)的研究對象。由于恒河猴在自然條件下也存在一定比例的結(jié)核分支桿菌的感染，為此對進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的恒河猴需要進(jìn)行體檢。最主要的一項(xiàng)是進(jìn)行OT測試。舊結(jié)核菌素試驗(yàn)采取猴外眼瞼皮內(nèi)注射的方式，注射0.1mL舊結(jié)核菌素。猴麻醉后，在猴的右上眼瞼皮內(nèi)注射舊結(jié)核菌素（ColoradoSerum Company生產(chǎn)的TuberculinMammalian, Human Isolates Intrademic）0.1mL，注射后24h，48h，72h觀察實(shí)驗(yàn)猴的舊結(jié)核菌素反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)前3只恒河猴未出現(xiàn)紅腫反應(yīng)，舊結(jié)核菌素反應(yīng)陰性。

3.2動物的飼養(yǎng)和運(yùn)輸

經(jīng)OT和X光檢測結(jié)核陰性的動物可以進(jìn)入ABSL-3實(shí)驗(yàn)室。動物麻醉后正常途徑進(jìn)入。進(jìn)入負(fù)壓猴籠飼養(yǎng)。常規(guī)猴糧，高壓滅菌水，每日飼以半個蘋果。溫度和濕度以及光照條件為常規(guī)ABSL-3實(shí)驗(yàn)室條件。

感染后猴子的運(yùn)輸采用專用猴運(yùn)輸箱，操作參考感染猴運(yùn)送SOP。

3.3結(jié)核分支桿菌的準(zhǔn)備

結(jié)核分支桿菌的復(fù)蘇 從ATCC購買的Erdman菌株（ATCC35810）或結(jié)核耐藥株（內(nèi)部編號94789），自-80℃冰箱取出，融化，用7H9液體培養(yǎng)基稀釋，分裝。取稀釋后的Erdman菌液接種L-J培養(yǎng)基斜面，100μL/支，37℃培養(yǎng)3周，菌落長至合適大小。在斜面上加3-4mL7H9培養(yǎng)基，將菌落自斜面上輕輕刮下，轉(zhuǎn)移至研磨器中，研磨均勻，將研磨好的菌液適當(dāng)稀釋，分裝，去一管轉(zhuǎn)接到L-J斜面生長用于菌落計(jì)數(shù)，其余菌放-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4恒河猴的麻醉和復(fù)蘇

在進(jìn)行纖支鏡和X光檢測時由于操作時間較長，需要使用長效麻藥復(fù)方氯胺酮麻醉動物，用生理鹽水1：5稀釋麻藥，稀釋液按照每公斤體重0.1ml的標(biāo)準(zhǔn)肌肉注射麻藥，麻醉動物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后肌肉注射蘇醒劑蘇醒3號。具體操作參考SOP。

3.5纖維支氣管鏡的感染操作

動物平放于手術(shù)車上，固定四肢。長時間操作需要給動物吸氧。按照纖維支氣管鏡儀器操作規(guī)則，在麻醉動物的齒間放入咬合器，通過咬合器從舌與上腭間插入支氣管鏡，注意觀察監(jiān)視器，找到聲門裂，小心插入支氣管鏡，進(jìn)入氣管后通過纖支鏡給藥通道注入2ml利多卡因（注射用）。

繼續(xù)向下，轉(zhuǎn)入右側(cè)肺至下葉位置。插入感染用纖支鏡噴灑導(dǎo)管，感染劑量100CFU。使用5mL注射器推入2mL菌液，之后再推入3mL空氣，排盡注射導(dǎo)管內(nèi)的殘余菌液。將纖支鏡連同注射管一同取出，進(jìn)行清洗。清洗程序注射管推入5mL生理鹽水，再推入消毒酒精5ml，推入清水5ml，推入生理鹽水5ml。取出注射管，纖支鏡用生理鹽水清洗。

檢測感染結(jié)核分支桿菌數(shù)量，感染用菌液經(jīng)L-J斜面培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

3.6動物靜脈取血

麻醉動物剪去肘部猴毛，暴露皮膚。酒精面擦拭皮膚表面消毒。5ml注射器靜脈采血，取抗凝血和自凝血。分別分離細(xì)胞和血清，進(jìn)行下列血沉、CRP、細(xì)胞因子、流式細(xì)胞學(xué)抗結(jié)核抗體等實(shí)驗(yàn)。血清分離后凍存于低溫冰箱。

3.7動物體溫測定

體溫芯片的植入：準(zhǔn)備好芯片掃描儀,檢查是否有電，給體溫芯片編號，將芯片錄入。麻醉動物后，選擇后頸部或上臂近后肩處，酒精棉消毒后，提起皮膚，在皮下植入體溫芯片，檢查芯片固定的位置，是否脫出，消毒進(jìn)針口。用芯片掃描一下檢驗(yàn)是否正常。

3.8動物的胸部X光檢查

檢查的頭一天晚上實(shí)驗(yàn)猴禁水食，檢查當(dāng)天對動物進(jìn)行麻醉，用數(shù)字X光機(jī)檢查肺部。使用的參數(shù)如下：

選擇狗的模式，設(shè)置參數(shù) 高度：64cm，厚度：12cm電壓：50kv 電流：1.8~2.4mA之間, 根據(jù)猴的大小，固定電壓值，調(diào)電流。

3.9 CT

檢查的頭一天晚上實(shí)驗(yàn)猴禁水食，檢查當(dāng)天對動物進(jìn)行麻醉，用數(shù)字X光機(jī)檢查肺部。

在人用的CT機(jī)器上選擇幼兒參數(shù)模式，調(diào)節(jié)電壓和電流使圖像分辨率達(dá)到要求，如電壓為120kv,電流為350mA。設(shè)置參數(shù)建立三維圖, 圖像存儲為dicom格式，用軟件計(jì)算病變的體積。

3.10 CRP檢測

取全血2ml于血清管中，4℃3000rpm離心20min分離血清。血清中C-反應(yīng)蛋白測定按照MONKEY C-REACTIVE PROTEIN(CRP)ELISA TEST KIT說明書進(jìn)行操作，結(jié)果以ng/ml表示。具體步驟為：按要求重懸標(biāo)準(zhǔn)品后，依次稀釋成75ng/ml，37.5 ng/ml，18.75ng/ml，9.38 ng/ml，4.69 ng/ml，2.34 ng/ml，1.17 ng/ml和0 ng/ml。將各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和1:1000稀釋后的動物血清分別加至已包被抗體的96孔板中，100ul/孔。室溫孵育45min，洗板后每孔加HRP標(biāo)記的檢測抗體100ul。室溫孵育45min后，洗板，加TMB 100ul/孔進(jìn)行顯色。室溫避光顯色20min后加終止液，于450nm處讀取OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每只動物感染后不同時間點(diǎn)時血清中的C-反應(yīng)蛋白含量。

3.11血沉檢測

恒河猴麻醉后，取全血1.6ml于檸檬酸鈉抗凝的血沉管中，顛倒混勻5—8次，垂直插在血沉架上，將血沉管血液的液面與血沉架上的0刻度線對齊，室溫靜置1h后觀察紅細(xì)胞下降的mm數(shù)。

3.12血清中結(jié)核抗體（IgG）的檢測

按照結(jié)核分支桿菌抗體診斷試劑盒（膠體金法）使用說明書進(jìn)行操作：將試劑和反應(yīng)板取出平衡至室溫，反應(yīng)板上依次標(biāo)號。在每個反應(yīng)孔中加2滴封閉液，待吸收完全后分別加入分離的血清各40ul，之后每孔加入洗滌液各6滴，待吸收完全后每孔加2滴金標(biāo)液進(jìn)行顯色。最后每孔加入6滴洗滌液，待吸收完全后目測結(jié)果。結(jié)果的判定以質(zhì)控點(diǎn)和反應(yīng)孔中間同時出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)為陽性，若質(zhì)控點(diǎn)顯示紅色，反應(yīng)孔中間無紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)或僅為痕跡者為陰性。

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌（結(jié)核菌）引起的一種慢性傳染性疾病，結(jié)核感染通常會累及肺、淋巴系統(tǒng)及其它多組織器官。除少數(shù)發(fā)病急促外，臨床上多呈慢性過程。常有低熱、乏力等全身癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)。感染后潛伏期4～8周，其中80%發(fā)生在肺部，其他部位（頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼）也可繼發(fā)感染。

排菌的肺結(jié)核患者是傳染源,人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。大多數(shù)的受感染者沒有病癥，稱為潛伏結(jié)核感（latentTBinfection），但其中約5-10%的潛伏感染者會發(fā)展至活動性結(jié)核；若無適當(dāng)治療，一個活動病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率則超過50%。若潛伏感染者同時罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病發(fā)機(jī)率。

肺結(jié)核病程較復(fù)雜，臨床分型有：1、原發(fā)型肺結(jié)核(Ⅰ型): 肺內(nèi)滲出病變、淋巴管炎和肺門淋巴結(jié)腫大的啞鈴狀改變的原發(fā)綜合征。兒童多見，僅表現(xiàn)為肺門和縱隔淋巴結(jié)腫大。 2、血型播散型肺結(jié)核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺結(jié)核及亞急性、慢性血型播散型肺結(jié)核。 3、繼發(fā)型肺結(jié)核(Ⅲ型):可以出現(xiàn)以增殖為主、浸潤為主、干酪病變?yōu)橹骰蛞钥斩礊橹鞯榷喾N病理改變。

結(jié)核菌進(jìn)入機(jī)體后，被巨噬細(xì)胞吞噬，結(jié)核菌毒力與宿主免疫力的抗衡決定著結(jié)核發(fā)病、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。結(jié)核病從感染、發(fā)病到轉(zhuǎn)歸均與多數(shù)細(xì)菌性疾病有顯著不同，宿主反應(yīng)具有特殊意義，反應(yīng)分為4期：1.起始期，入侵呼吸道的結(jié)核菌被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬細(xì)胞非特異性殺菌能力的不同，被吞噬結(jié)核菌的命運(yùn)各異。2.T細(xì)胞反應(yīng)期，由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫（CMI）和遲發(fā)性過敏反應(yīng)（DTH）在此期形成，從而對結(jié)核病發(fā)病、演變及轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生決定性影響。3.共生期，大部分感染者結(jié)核菌可以持續(xù)存活，細(xì)菌與宿主處于共生狀態(tài)。纖維包裹的壞死灶干酪樣中央部位被認(rèn)為是結(jié)核桿菌持續(xù)存在的主要場所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使細(xì)菌不能增殖。宿主的免疫機(jī)制亦是抑制細(xì)菌增殖的重要因素，倘若免疫損害便可引起受抑制結(jié)核菌的重新活動和增殖。4.細(xì)胞外增殖和傳播期，固體干酪灶中包含具有生長能力、但不繁殖的結(jié)核菌。干酪灶一旦液化便給細(xì)菌增殖提供了理想環(huán)境。即使免疫功能健全的宿主，從液化干酪灶釋放的大量結(jié)核桿菌亦足以突破局部免疫防御機(jī)制，引起播散。

結(jié)核病的全身癥狀是全身乏力、午后低熱、盜汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道癥狀是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困難等。其特征性病理改變是肉芽腫病變和結(jié)核性結(jié)節(jié)，其基本病理變化為滲出性病變、增生性病變和壞死性病變。滲出性病變以炎癥細(xì)胞、單核細(xì)胞肌纖維蛋白為主要成分，增殖性改變以結(jié)核結(jié)節(jié)及結(jié)合性肉芽腫為主，壞死的特征性改變?yōu)楦衫覙痈淖儭＝Y(jié)核性炎癥的主要特是上皮樣細(xì)胞結(jié)節(jié)及郎格漢斯細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室痰培養(yǎng)為菌陽性，抗酸染色可見細(xì)長略彎曲的桿菌，血沉加快。肺的原發(fā)病灶、淋巴管炎和肺門淋巴結(jié)結(jié)核合稱為原發(fā)綜合癥，X線影像學(xué)上的典型表現(xiàn)為啞鈴狀陰影。感染3-8周后結(jié)核菌素皮試轉(zhuǎn)陽，95%的健康感染者原發(fā)綜合征自然消退，成為潛伏感染人群，約5%在日后因潛在感染復(fù)燃而發(fā)病,結(jié)核病起病緩慢，病程較長。