PD-L1作為機體內(nèi)重要的免疫通路分子，其在結核等疾病中的作用機制尚不明確。PD-L1廣泛表達于多個免疫細胞，其中巨噬細胞是結核等疾病感染免疫的重要分子，是結核特征性肉芽腫病變的關鍵細胞，巨噬細胞上PD-L1表達在結核中發(fā)揮什么作用，需要巨噬細胞上PD-L1特異性敲除小鼠來進行研究。

目前無文獻或者資源庫可以檢索到巨噬細胞上PD-L1特異性敲除的動物模型，本課題組制備的模型巨噬細胞上PD-L1特異性敲除的動物模型可以用于結核或其他巨噬細胞免疫機制相關的研究，PD-L1作為機體內(nèi)重要的免疫通路分子，該模型的應用必將廣泛。

本模型不涉及除遺傳物質(zhì)重組對環(huán)境生態(tài)影響以外的其它安全性問題，本模型小鼠的保存、使用和處理均按照研究所倫理和安全委員會的要求執(zhí)行，可以確保不產(chǎn)生安全性問題。

1、基因鑒定：

圖2 PCR鑒定敲除小鼠的基因

2、 表型分析（包括生理生化、解剖學、生物學特征等）

繁殖性能：產(chǎn)仔率：89～95％??平均窩產(chǎn)仔數(shù)：6.98～7.48只??胎間隔：28～36天??離乳存活率：87～93％

2.2 流式檢測腹腔巨噬細胞、T細胞、B細胞PD-L1表達

如下圖所示，表明該小鼠模型的巨噬細胞上PD-L1是特異性敲除的。

圖3 流式細胞術檢測巨噬細胞、T和B細胞上PD-L1的表達

注：藍色峰為Flox/+ with cre小鼠，紅色峰為Flox/Floxwith cre小鼠，綠色峰為Flox/Flox no cre小鼠

（一）巨噬細胞上特異性小鼠制備的原理

條件性基因敲除小鼠的設計利用了位點特異性重組酶系統(tǒng)Cre/LoxP原理，需要在待敲除的一段目標DNA序列的兩端各放置一個loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。將flox小鼠與帶有組織或細胞特異性表達cre的小鼠交配繁殖，以獲得在特定細胞或者組織里把目的基因敲除掉的小鼠，即條件性基因敲除小鼠。

如下圖：

圖1 特異性敲除的原理

（二）條件敲除小鼠的繁殖和鑒定

1. 收到F0和F1小鼠后，首先確認每只小鼠的腳趾編號是否吻合。

2. F0和F1小鼠由于數(shù)量較少，以后需要的動物多，與野生交配，盡量多繁殖，以備后續(xù)的研究。

3. 獲得小鼠后，提取基因組DNA，PCR擴增，進行基因型鑒定，并利用流式進行表型鑒定。

4. 繁殖方法有多種，以下為一種舉例：

首先將PD-L1Flox/-小鼠和C57BL/6小鼠進行雜交，得到PD-L1Flox/-小鼠，然后將PD-L1Flox/-小鼠進行自交，得到PD-L1Flox/Flox小鼠，將雌性PD-L1Flox/Flox小鼠和帶有巨噬細胞特異性表達 Cre 酶的Lyz2-iCre雄鼠進行雜交，得到PD-L1Flox/- with Cre小鼠，最后將PD-L1Flox/Flox小鼠和PD-L1Flox/- with Cre小鼠雜交，得到1/4的PD-L1Flox/Flox with Cre小鼠，即為巨噬細胞特異性PD-L1敲除小鼠。

1、xx（細胞/基因/病原/其他造模因素）信息

利用 CRISPR/Cas9技術，特異性敲除小鼠巨噬細胞上的PD-L1基因

2、實驗動物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

該動物模型的研究目的及意義；該動物模型的國內(nèi)外研究進展并附參考文獻。

PD-L1作為機體內(nèi)重要的免疫通路分子，其在結核等疾病中的作用機制尚不明確。PD-L1廣泛表達于多個免疫細胞，其中巨噬細胞是結核等疾病感染免疫的重要分子，是結核特征性肉芽腫病變的關鍵細胞，巨噬細胞上PD-L1表達在結核中發(fā)揮什么作用，需要巨噬細胞上PD-L1特異性敲除小鼠來進行研究。