CTLA4敲除小鼠模型
討論與結(jié)論
為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細(xì)胞中的功能，我們運(yùn)用CRISPER/Cas9技術(shù)對斑馬魚npsn進(jìn)行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點(diǎn)獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點(diǎn)處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對于野生型斑馬魚出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。
為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育，我們通過斑馬魚中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號點(diǎn)的數(shù)量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽性細(xì)胞的數(shù)量也沒有差異。并且進(jìn)一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細(xì)胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因?yàn)镹psn只是斑馬魚中性粒細(xì)胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細(xì)胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細(xì)胞的某些功能。
為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細(xì)胞功能的影響，而中性粒細(xì)胞的主要功能是參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實(shí)驗(yàn)。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達(dá)水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細(xì)胞在抵抗細(xì)菌感染中存在功能缺陷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Npsn在中性粒細(xì)胞抵抗感染中的作用，我們通過構(gòu)建斑馬魚Npsn過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過表達(dá)后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個結(jié)果進(jìn)一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細(xì)菌感染。
但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細(xì)胞抵抗感染的呢？先前有體外實(shí)驗(yàn)證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗(yàn)證這個觀點(diǎn)，我們觀察了在感染后4小時時傷口處中性粒細(xì)胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細(xì)胞的完整性，進(jìn)而影響大腸桿菌在機(jī)體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗(yàn)證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細(xì)胞抵抗細(xì)菌感染的具體機(jī)制，還需要更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應(yīng)模型，對研究在感染過程中，中性粒細(xì)胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。
生物安全性
動物模型的制備和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開展。動物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。
評價驗(yàn)證
4.1CTLA4敲除小鼠模型的建立
將F0代小鼠與C57小鼠進(jìn)行雜交，獲得雜合子CTLA4 +/-,將雜合子互交并將子代進(jìn)行基因型鑒定（圖2），得到純合敲除小鼠CTLA4 -/-。
圖2 PCR鑒定子代小鼠基因型
注：使用PCR鑒定子代小鼠基因型，突變可傳代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。-/-：CTLA4基因敲除純合子小鼠；+/-：CTLA4基因敲除雜合子小鼠；+/+：野生型小鼠。
4.2CTLA4敲除小鼠生存率及體重變化
早有研究表明，CTLA4基因敲除小鼠會在出生后1月內(nèi)，由于嚴(yán)重的自身免疫疾病死亡。我們統(tǒng)計(jì)了小鼠出生后的生存率及體重變化，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周內(nèi)死亡（圖3a）。CTLA4基因敲除小鼠在出生后2周時體重與野生型小鼠相差不多，但在3-4周時體重明顯輕于野生型小鼠（圖3b），體型也更小（圖3c）。
圖3 CTLA4基因敲除小鼠生存率及體重變化
注：a：CTLA4基因敲除及同窩野生型小鼠出生后8周內(nèi)的生存率，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周內(nèi)死亡（n=8）。b: CTLA4基因敲除及同窩野生型小鼠出生4周內(nèi)的體重變化，CTLA4基因敲除小鼠在出生2周后體重增長緩慢（n=6）。c：CTLA4基因敲除及同窩野生型小鼠體型對比。
4.3CTLA4敲除小鼠組織中蛋白表達(dá)
為了鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠是否在蛋白水平發(fā)生CTLA4敲除，取1-2月齡小鼠脾、肺進(jìn)行Western Blot，分別使用種屬反應(yīng)性為小鼠、大鼠和人的CTLA4抗體檢測蛋白表達(dá)（圖4）。
圖4CTLA4在敲除小鼠中的蛋白及mRNA表達(dá)
注：+/+：野生型小鼠；-/-：CTLA4基因敲除純合子小鼠。
4.4敲除CTLA4基因可導(dǎo)致自身免疫疾病
文獻(xiàn)報(bào)道，CTLA4基因敲除小鼠會由于嚴(yán)重的自身免疫疾病，在出生后3-4周內(nèi)死亡，這與我們觀察到的結(jié)果相似。HE染色結(jié)果顯示，CTLA4敲除小鼠表現(xiàn)出淋巴樣細(xì)胞向非淋巴組織（如心臟、肝臟）的浸潤（圖5b，d）。
圖5組織中淋巴細(xì)胞浸潤
注：在CTLA4-/-小鼠中，淋巴細(xì)胞廣泛浸潤到非淋巴組織中（b, d），圖中顯示的是心臟（a，b）和肝（c，d）的組織切片HE染色。比例尺=100μm。
制備方法
3.1.4 模型構(gòu)建流程
利用CRISPR /Cas9 技術(shù)，建立CTLA4基因敲除小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法進(jìn)行鑒定及分析。
3.1.5 CTLA4敲除小鼠的建立
3.1.5.1 CTLA4敲除小鼠模型的建立
（1）設(shè)計(jì)方案
一、載體構(gòu)建
1.sgRNA 載體
載體名稱：pUC57-sgRNA expression vector
Addgene ID: 51132
根據(jù)基因信息選擇靶點(diǎn)，合成sgRNA（上海英濰捷基）
targeting site 1:
gggttcaaacacatctcaagg
m-ctla4-gRNA up1 5’TAGGgggttcaaacacatctca
m-ctla4-gRNA down1 5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC
targeting site 2:
gagacttctggaacatggaGg
m-ctla4-gRNA up2 5’TAGGgagacttctggaacatgg
m-ctla4-gRNA down2 5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC
合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSAⅠ線性化的載體
sgRNA插入位點(diǎn)示意圖
圖1CTLA4敲除小鼠模型構(gòu)建設(shè)計(jì)方案
構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。（體外轉(zhuǎn)錄用試劑盒：Ambion Am1354）
2，CAS9 載體
載體名稱：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9
Addgene ID: 44758
載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA（體外轉(zhuǎn)錄用試劑盒：Ambion Am1345）
顯微注射：
1、超數(shù)排卵：15只3-4周齡c57雌鼠注射激素進(jìn)行超排。
2、受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。
3、雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的c57雄鼠。
4、受體鼠制備：8-10周齡ICR雌鼠與結(jié)扎的ICR雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
5、胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次， 120枚卵，4只受體鼠）。
基因型鑒定：
1、剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號及取材。
2、基因組DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA
3、PCR檢測：根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)檢測引物（上海英濰捷基）
M-CTLA4-KO-S 5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG
M-CTLA4-KO-A 5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC
KO：
TM=62℃WT：727bp ko:(見測序分析)
PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序（TaKaRa RR042A）
反應(yīng)體系：
l10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+ Plus)
l2.0 μl
ldNTP Mixture(2.5 μM)
l1.6 μl
l引物-S（50μM ）
l0.2 μl
l引物-A（50μM ）
l0.2 μl
l模板DNA
l2.0 μl
lLA Taq
l0.2 μl
l補(bǔ)加ddH2O至總體積
l20.0μl
擴(kuò)增程序：
l95℃
l15 min；
l95℃, 30 s
lTM-2℃, 30 s
l72℃, 2 min 30循環(huán)；
l72℃
lmin；
6×loading buffer 終止反應(yīng)。
用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。
4、結(jié)果分析： 選取PCR檢測分子量不同于野生型條帶的 (下圖中箭頭所示)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
1-23#基因組PCR結(jié)果圖（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR結(jié)果）
1-23#基因組PCR結(jié)果圖（TaKaRa marker DL2000）（KO PCR結(jié)果）
5、測序結(jié)果：
KO：4#，6#，7#，10#，15# 灰色為缺失部分
4#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
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3.1.5.2 動物繁殖和表達(dá)圖譜分析
獲得F0代后，首先通過與野生型C57小鼠進(jìn)行雜交，進(jìn)行基因修飾小鼠傳代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通過雜合子與雜合子雜交，獲得CTLA4敲除小鼠純合子小鼠，進(jìn)行蛋白表達(dá)分析，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.1.5.3 鼠尾基因組DNA鑒定
在幼崽出生后剪腳趾標(biāo)記，并剪尾至1.5 mL EP管。然后參照鼠尾直接PCR試劑盒（bimake）說明書按以下程序操作。
1.1. 按小鼠數(shù)量配制組織消化液，試劑比例如下：
（單樣本）
Protease Plus
2 μL
Buffer L
100 μL
組織消化液現(xiàn)用現(xiàn)配，充分混勻后使用。
1.2. 向每個含有樣本的EP管中加入100 μL新鮮組織消化液，55℃水浴/金屬浴中消化15 min。組織消化時，務(wù)必將組織完全浸沒于消化液中。消化完成后，組織外觀上仍然完整，但足量的基因組DNA已經(jīng)釋放，不影響后續(xù)的PCR實(shí)驗(yàn)。
1.3. 將樣本置于95℃水浴/金屬浴中孵育5 min以滅活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm離心5分鐘，取上清作為PCR模板。消化后的上清或連同組織的消化液可于-20℃保存三個月。
2. PCR擴(kuò)增2.1. PCR反應(yīng)體系：
PCR 反應(yīng)組分
20 μL 反應(yīng)體系 (μL)
50 μL 反應(yīng)體系 (μL)
ddH2O
8
21
正向引物 (10 μM)
0.5
1
反向引物 (10 μM)
0.5
1
模板（消化產(chǎn)物）
1
2
2 x M-PCR OPTI? Mix
10
25
注：模板體積可以適當(dāng)調(diào)整。
2.2. PCR反應(yīng)條件：
溫度 (℃)
時間
循環(huán)數(shù)
94
5 min
1
94
20 sec
35
60
30 sec
72
X min (2kb/min)
72
5 min
1
12
--
1
3. 瓊脂糖凝膠電泳試劑2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚藍(lán)染料，PCR產(chǎn)物可直接點(diǎn)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
研究背景
1、造模因素信息
小鼠CTLA4基因位于第一號染色體的1C2區(qū)段（Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832，ENSMUSG00000026011）
2、實(shí)驗(yàn)動物背景信息
c57bl/6小鼠也被稱為c57 black 6，1921年被培育出來，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個特點(diǎn)就是品系穩(wěn)定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一個完成基因組測序的小鼠品系。
3、研究背景
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)（CD152）和CD28是表達(dá)在CD4 +和CD8 + T細(xì)胞的同源受體，兩者共享在抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)的一對配體，并且在T細(xì)胞活化中介導(dǎo)相反的功能。配體與CD28相互作用，介導(dǎo)T細(xì)胞與T細(xì)胞受體（TCR）信號共刺激。CTLA4最初被發(fā)現(xiàn)是一種傳遞抑制信號，對于終止免疫反應(yīng)非常重要[1, 2]。T細(xì)胞活化受到CTLA4的負(fù)面調(diào)節(jié)，例如與CD28競爭與它們共同的配體B7.1和B7.2的結(jié)合[3]。盡管CTLA4調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的確切機(jī)制仍存在爭議，但CTLA4的抑制功能受到廣泛認(rèn)可[4]。所有CTLA4 敲除小鼠在淋巴結(jié)和脾臟均顯示大量淋巴細(xì)胞增殖，隨后白細(xì)胞對幾乎所有組織進(jìn)行自身免疫攻擊，并導(dǎo)致小鼠過早死亡[1, 2, 5]。
[1]Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4[J]. Science, 1995, 270(5238): 985-8.
[2]Tivol EA, Borriello F, Schweitzer AN, et al. Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4[J]. Immunity, 1995, 3(5): 541-7.
[3]Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily[J]. Nature reviews Immunology, 2002, 2(2): 116-26.
[4]Egen JG, Kuhns MS, Allison JP. CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy[J]. Nature immunology, 2002, 3(7): 611-8.
[5]Chambers CA, Sullivan TJ, Allison JP. Lymphoproliferation in CTLA-4-deficient mice is mediated by costimulation-dependent activation of CD4+ T cells[J]. Immunity, 1997, 7(6): 885-95.
模型信息
中文名稱:CTLA4敲除小鼠模型
英文名稱:CTLA4 knockout mouse _model
類型:免疫疾病模型
分級:NA
用途:自身免疫疾病研究。
研制單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所
保存單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所
