該項(xiàng)研究系統(tǒng)分析了新冠肺炎癥狀明顯期水貂病理改變和代謝紊亂的特征，建立了一個(gè)理想的新冠病毒感染重癥動(dòng)物模型，模擬了新冠病毒引起的機(jī)體系統(tǒng)和嚴(yán)重的病理改變特征。

所有涉及的病毒實(shí)驗(yàn)操作全部在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 ABSL 3 實(shí)驗(yàn)室完成，該實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)具備相關(guān)實(shí)驗(yàn)室和福利倫理資質(zhì)。

構(gòu)建可以模擬臨床重型和危重型患者的動(dòng)物模型，勾勒出新冠肺炎癥狀明顯期水貂模型肺組織和肺外多組織臟器時(shí)相性動(dòng)態(tài)變化病理全景圖。與臨床重癥患者的報(bào)道一致，受感染的水貂病理損傷累及多個(gè)臟器，表現(xiàn)出多器官和系統(tǒng)的病變，伴有炎癥反應(yīng)顯著增加，病毒在肺臟（圖1）、心血管（圖2）、肝膽（圖3）、泌尿、內(nèi)分泌（圖4）、消化和免疫系統(tǒng)廣泛分布。更重要地，血清的脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析表明，水貂在感染后6dpi的變化與臨床重型和危重型COVID-19患者極為相似（圖5），且這種變化與其組織病理學(xué)改變息息相關(guān)。特別是代謝途徑改變，維生素、脂類、膽固醇、類固醇、氨基酸和蛋白質(zhì)的消化和吸收異常，肝功能障礙等，表明機(jī)體代謝和免疫失調(diào)。在感染后水貂血清中，升高的犬尿氨酸促進(jìn)了犬尿氨酸代謝通路的顯著激活，并與巨噬細(xì)胞的激活有關(guān)，解釋了病毒與激活的巨噬細(xì)胞在全身多臟器共定位的現(xiàn)象。另外，我們篩選出數(shù)種重要的代謝產(chǎn)物具有作為疾病治療靶向分子和潛在生物標(biāo)志物的可能（圖6）。

與對照組相比，感染后第一天（1dpi）水貂肺組織即表現(xiàn)出急性炎癥和間質(zhì)增寬，在疾病發(fā)展過程中，4到6dpi病理損傷最嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為重度間質(zhì)性肺炎，肺泡間隔嚴(yán)重增寬，多個(gè)肺泡融合，肺泡上皮增生，肺泡腔內(nèi)有彌漫的滲出液和炎性細(xì)胞滲出物以及脫落變性壞死的上皮細(xì)胞。對1-6dpi的肺組織病毒RNA檢測時(shí)，每只動(dòng)物都觀察到病毒RNA，14天時(shí)仍然有2/3動(dòng)物肺組織檢測出少量病毒RNA。免疫組化檢測結(jié)果與之一致，4-6dpi時(shí)肺組織內(nèi)的病毒抗原最多。另外，4dpi時(shí)肺臟的滲出最為明顯，14dpi可以觀察到纖維結(jié)締組織增生（圖1）。

1試驗(yàn)材料

1.1 病毒株

SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中國疾控中心譚文杰教授提供，新型冠狀病毒的全基因組序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan /IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)獲得，存放于中國微生物數(shù)據(jù)中心（登錄號NMDC10013001，基因組登錄號MDC60013002-01）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF 級6 周至 11月齡各段的ICR 與 C57 BL/ 6J，18-22 g，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所（IACUC 批準(zhǔn)號：BLL20001）

2試驗(yàn)操作規(guī)程

2.1 人 hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

表達(dá)人 hACE2 基因的小鼠，由小鼠ACE2 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，經(jīng) RT-PCR 和 Western blot 驗(yàn)證 hACE2 基因在小鼠肺組織內(nèi)的表達(dá)（圖3）[4]。

2.2 病毒傳代

將新型冠狀病毒接種到Vero細(xì)胞進(jìn)行分離和儲(chǔ)存。Vero細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM（英濰捷基, 美國）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中，環(huán)境為37°C，5%CO2。新型冠狀病毒的病毒滴度用標(biāo)準(zhǔn)的半數(shù)細(xì)胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）進(jìn)行分析。

2.3 動(dòng)物模型的感染方法

（1） 途徑：滴鼻；

（2） 感染劑量：1× 105 TCID50 只；

（3） 感染體積：50 μl 只；

（4） 對照組：等體積 PBS。

2.4 動(dòng)物模型分析

（1）癥狀觀察：感染后，每天觀察動(dòng)物一般癥狀，記錄體重。

（2）病毒載量：定時(shí)收集各組動(dòng)物臟器，進(jìn)行RNA抽提，利用RT-PCR技術(shù)，檢測組織中病毒載量。RT-PCR所用的新型冠狀病毒引物如下：上游為5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游為5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分離：肺組織在 DMEM 溶液中研磨制備成勻漿，離心分離上清后，接種于Vero細(xì)胞分離病毒并觀察細(xì)胞病變。

（4）病理學(xué)觀察 用新鮮的組織制備冰凍切片，將組織固定在冷凍劑上，肺臟組織（10um）切好后在 100% 丙酮內(nèi)固定 15 分鐘，之后用 HE染色，鏡下觀察。

（5）免疫熒光染色肺臟切片用PBS洗三遍，用固定液充分固定，用封閉液室溫封閉 1h，一抗4°C 封閉過夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小時(shí)， PBS 洗三遍。用 DAPI 染細(xì)胞核觀察新型冠狀病毒在小鼠肺臟上的定位。新型冠狀病毒一抗為病人恢復(fù)期血清，羊源抗人二抗用， FITC 標(biāo)記。

（6）感染后第14天，分離血清，測定特異性IgG。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法

所有的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0 軟件分析，感染組小鼠和其他對照組小鼠用T 檢驗(yàn)方法分析差異，顯著性差異用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

早在2020年4月，很多國家就發(fā)生了水貂養(yǎng)殖場內(nèi)新冠病毒可能由感染新冠的員工引入養(yǎng)殖場，傳給水貂的系列事件，經(jīng)濟(jì)損失慘重。病毒可在水貂之間傳播，在水貂間傳播的過程中發(fā)生突變，也可從水貂傳給養(yǎng)殖場的其他動(dòng)物。水貂還可能將病毒傳播給水貂養(yǎng)殖場人員，以上數(shù)據(jù)都表明水貂對新冠病毒高度易感。構(gòu)建新冠肺炎水貂模型，系統(tǒng)地研究新冠病毒感染水貂后的致病機(jī)制和生理病理學(xué)改變，為闡述臨床病理機(jī)制，藥物和疫苗評價(jià)，生物標(biāo)志物篩選提供良好的動(dòng)物模型。