1 技術難點

（1）小鼠乳腺癌原位接種：在接種過程中難以把控是否接種在乳房墊而不是皮下，否則建模失敗。

（2）小鼠體內血行轉移過程中，腫瘤細胞與血小板形成的復合物難以富集，導致觀察受礙。

2 創(chuàng)新性

（1）模擬腫瘤生長及轉移全過程，考慮腫瘤微環(huán)境對腫瘤細胞轉移產生的重要影響。

（2）模擬抗腫瘤轉移的常規(guī)治療方法，更直接的評價抗腫瘤轉移藥物的藥效。

（3）檢測體內腫瘤細胞-血小板聚集體，使檢測結果更加直觀、可靠。

（1）4T1乳腺原位腫瘤移植模型構建

將Luc標記的小鼠乳腺癌細胞4T1細胞經皮下接種至BALB/C小鼠，用活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤面積顯著增大，小鼠可存活45天以上，能夠觀察到明顯的肺轉移及其它臟器的轉移。

（2）4T1腫瘤手術切除及術后轉移成像

在原位腫瘤手術摘除后當天，小鼠熒光成像結果表明：（1）小鼠原位腫瘤的影像完全消失，證明原位腫瘤手術摘除完全，不存在原位腫瘤的殘留，從而避免了術后殘留對腫瘤轉移進展的干預和影響；（2）小鼠中均出現(xiàn)了數(shù)量較多、成像明確、以肺轉移為主的乳腺癌轉移的陽性影像，從而證明，我們構建的乳腺癌體內轉移模型有效、可信。

（3）4T1血行轉移及T-P互作評價：

免疫熒光染色后可以觀察到明顯的血小板CD61（紅色）和MHCI類（黃色）呈陽性；流式細胞儀下CEA陽性表達者為循環(huán)腫瘤細胞，同時可共同表達血小板標記物CD41a者則表明循環(huán)腫瘤細胞在體內被血小板包覆；NK細胞在腫瘤細胞與血小板互作的條件下，其數(shù)量及殺傷活性低于正常血液NK細胞。

（1）4T1乳腺原位腫瘤移植模型構建

將Luc標記的小鼠乳腺癌細胞4T1細胞經皮下接種至BALB/C小鼠，用活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤面積顯著增大，小鼠可存活45天以上，能夠觀察到明顯的肺轉移及其它臟器的轉移。

（2）4T1腫瘤手術切除及術后轉移成像

在原位腫瘤手術摘除后當天，小鼠熒光成像結果表明：（1）小鼠原位腫瘤的影像完全消失，證明原位腫瘤手術摘除完全，不存在原位腫瘤的殘留，從而避免了術后殘留對腫瘤轉移進展的干預和影響；（2）小鼠中均出現(xiàn)了數(shù)量較多、成像明確、以肺轉移為主的乳腺癌轉移的陽性影像，從而證明，我們構建的乳腺癌體內轉移模型有效、可信。

（3）4T1血行轉移及T-P互作評價：

免疫熒光染色后可以觀察到明顯的血小板CD61（紅色）和MHCI類（黃色）呈陽性；流式細胞儀下CEA陽性表達者為循環(huán)腫瘤細胞，同時可共同表達血小板標記物CD41a者則表明循環(huán)腫瘤細胞在體內被血小板包覆；NK細胞在腫瘤細胞與血小板互作的條件下，其數(shù)量及殺傷活性低于正常血液NK細胞。

2.1 小鼠乳腺癌原位腫瘤模型建立及術后干預

對小鼠高侵襲力乳腺癌進行體外培養(yǎng)和擴增，并將細胞狀態(tài)和增殖水平調整至最佳水平。在此基礎上，收獲腫瘤細胞，并對細胞進行準確計數(shù)，按照1*104/100ul的細胞濃度將細胞在無菌生理鹽水中稀釋成單細胞懸液，置于冰上備用。

在小鼠的準備上，本實驗選用在SPF級飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)的Bab/c小鼠，雌性、周齡6—8周。在接種腫瘤正式實驗前，小鼠進行了3天的適應性飼養(yǎng)，并在腫瘤接種前一天進行腹部去毛備皮，充分暴露小鼠第四對脂肪墊的皮膚，利于腫瘤接種。

在腫瘤接種時，將備好的細胞懸液接種于小鼠乳房的第四對脂肪墊中，并在接種時注意接種部位和接種深度的選擇。針頭不能穿過脂肪墊進入腹腔中，也不能插入過淺，接種于皮下，同時還需注意進針位置和角度，防止腫瘤溶液溢出，從而影響腫瘤接種的數(shù)量差異。

在小鼠準確接種腫瘤細胞后，對小鼠持續(xù)飼養(yǎng)5-7天，待原位腫瘤明確形成并得到初步增殖擴大后，開始對各組小鼠進行隨機分組給藥。給藥途徑選取為腹腔注射給藥，給藥體積為200ul，各給藥組設定為藥物溶劑注射陰性對照組（NC）、0.1mg/kg（ESC-L）和1mg/kg（ESC-H）組。每日給藥一次，并定期觀測記錄小鼠體重、原位腫瘤的生長狀態(tài)和瘤體積。

在小鼠日常給藥30—40天后，當原位腫瘤的瘤體積生長達到相應水平后，將小鼠的原位腫瘤進行切除。手術時，選用戊巴比妥（40mg/kg）注射和異氟烷吸入混合麻醉，從而保證了麻醉深度和麻醉安全性。在手術移除原位腫瘤時，需注意將原位腫瘤盡可能切除干凈，從而有效避免腫瘤復發(fā)和原發(fā)部位腫瘤對后續(xù)轉移進程的實驗干擾。在原位腫瘤術后，在飼養(yǎng)水中加入慶大霉素，并對術后小鼠每日進行腹腔局部消毒。以保證小鼠順利度過手術感染期。

在小鼠術后感染期度過后（約3-5天），繼續(xù)對小鼠開始藥物干預。并于藥物干預持續(xù)20天后，作為實驗終點。處死小鼠，獲得各重要器官臟器，檢測其病理性變化，并著重對乳腺癌主要轉移靶器官（骨、肝、腦、肺）的轉移水平進行評價和拍照，并保存標本，用于后續(xù)的組織、細胞和分子水平檢測。

圖1 乳腺癌轉移體內藥效學評價平臺及基本實驗流程簡介。上圖：荷瘤小鼠體內成像實驗的基本流程示意圖。下圖：小鼠原味腫瘤接種的位置示意圖及分組情況說明。

圖2 4T1-LUC小鼠原位腫瘤生長的活性動態(tài)檢測。圖中分別展示了小鼠隨機分組給藥第一天(A)、第五天(B)、第十天(C)、第二十天(D)和第二十五天(E)的原位腫瘤成像結果。

圖3.4T1-LUC荷瘤小鼠轉移進程的活性。圖中分別顯示了原位腫瘤切除當天(A)、術后持續(xù)化療10天(B)和20天(C)的小動物成像結果。

2.2 T-P體內復合物及NK細胞檢測

抽取小鼠外周血，對血小板糖蛋白IIIa(CD61)和MHCI類進行熒光染色，觀察其熒光染色情況以確定腫瘤細胞與血小板之間存在相互作用；應用流式細胞儀分析CEA及血小板標記物CD41a，以確定循環(huán)腫瘤細胞在體內被血小板包覆；應用流式細胞儀檢測外周血NK細胞標記物CD56以確定其數(shù)量；應用LDH法及WST-8試劑盒驗證NK細胞殺傷活性。

轉移是惡性腫瘤的關鍵特征之一，其發(fā)生不可避免及轉移灶難以治愈的特點是導致90%以上癌癥患者死亡的主要原因[1]。現(xiàn)有治療方法主要采用手術切除、化療和放療，但均存在著毒副作用強、易復發(fā)等局限性[2]。且在實驗研究中，目前的動物實驗模型無法有效真實模擬腫瘤轉移及臨床治療過程，故亟需一特異性模擬腫瘤發(fā)生、轉移、定植全鏈條，符合當前抗腫瘤轉移藥物治療基本流程規(guī)范的動物模型，更直接、可信的評價抗腫瘤轉移藥物治療效果。

1. 腫瘤與微環(huán)境二元整合互作是腫瘤轉移調控的功能單元和機制基礎。

早在1889，英國醫(yī)生Stephen Paget針對轉移過程提出了“種子-土壤”假說，把惡性腫瘤比作種子，通過血液循環(huán)或淋巴道轉移到遠端，尋找到適合其生長的環(huán)境，即所謂的“土壤”，形成轉移灶，進而發(fā)展為繼發(fā)性腫瘤[3]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)轉移前的腫瘤“土壤”因素可以通過增強“種子”的轉移特性及侵襲能力等，促進轉移的發(fā)生[4]。而這種由腫瘤細胞和“土壤”中多種間質細胞、細胞因子、趨化因子等相互作用后形成的利于腫瘤生存的特殊環(huán)境，稱為腫瘤微環(huán)境（tumormicroenvironment, TME）。TME主要由成纖維細胞和肌成纖維細胞、神經內分泌細胞、免疫和炎癥細胞、血管和淋巴管系統(tǒng)以及細胞外基質組成，在轉移發(fā)生時中各司其職、相互影響，直接或間接促進轉移進程[5]。例如，腫瘤內的血管系統(tǒng)表現(xiàn)出結構和功能特性的改變，導致缺氧和營養(yǎng)供應有限，從而改變腫瘤細胞的基因表達，提高細胞的存活和對凋亡誘導的抵抗[6]。TME在轉移研究中受到越來越廣泛地關注，其不僅在轉移全過程中發(fā)揮著關鍵作用，更影響著臨床治療效果，在抗腫瘤轉移中不可忽視，可作為一具強吸引力的治療靶向，降低腫瘤耐藥性及復發(fā)風險。

1.2乳腺癌腫瘤微環(huán)境調節(jié)是腫瘤治療的未來的重點領域和關鍵靶點。

乳腺癌（breastcancer, BC）是女性最常見的癌癥，也是全世界女性癌癥患者死亡的主要病癥，其高轉移性、高侵襲性、高復發(fā)率的特性對廣大女性健康和生命安全造成極大威脅[7]。隨著治療觀點及方法的不斷進步，諸多研究認為，乳腺癌的發(fā)生并非乳腺腫瘤細胞單方面的作用，而是乳腺癌與其所處的TME相互作用引起的[7]。

在分析TME與乳腺癌細胞互作對轉移的影響中，研究人員多聚焦于脂肪細胞、成纖維細胞以及免疫炎癥細胞三個方面：（1）腫瘤相關脂肪細胞是乳腺組織中占比最大的細胞，表現(xiàn)為惡性表型，其脂質含量及晚期脂肪細胞分化標志物減少，并過表達炎癥因子與蛋白酶，通過釋放多種脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素、白細胞介素、趨化因子配體2等，促進BC的增殖、血管生成、擴散、侵襲和轉移；（2）腫瘤相關成纖維細胞是TME中最大的基質細胞群，其可通過影響雌二醇水平，分泌多種因子和基質金屬蛋白酶（matrix metallo-proteinase, MMPs），誘導干細胞、表觀遺傳改變等促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，還可通過增加MMP14的表達和MMP9的活性，誘導原位癌上皮細胞在體內外的侵襲能力[8]。（3）腫瘤相關免疫炎癥細胞會阻礙藥物進入腫瘤細胞內發(fā)揮藥效，例如巨噬細胞可重塑基質，產生的MMPs、半胱氨酸組織蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，允許細胞外基質（extracellular matrix, ECM）破壞以及隨后的腫瘤細胞侵入周圍組織，從而引導腫瘤細胞轉移[9]。

目前的治療方法除集中于提高對腫瘤細胞的殺傷能力，也逐漸的靶向TME中的基質細胞。TME作為乳腺癌細胞賴以生存的“土壤”，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，且基質細胞的基因組穩(wěn)定性使其成為新型抗癌治療劑的理想靶標，發(fā)生治療耐藥性的風險降低，使得TME基質細胞靶向治療成為未來有潛力的抗乳腺癌治療方法。

1.3乳腺癌微環(huán)境包括原位腫瘤微環(huán)境與血液微環(huán)境兩部分，是腫瘤轉移的重要決定要素，也是中藥抗腫瘤轉移有效性評價和科學性闡釋的核心領域。

1.3.1乳腺癌原位腫瘤的特征性描述

在乳腺原位癌TME中，腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAM)是最豐富的免疫細胞群，可促進腫瘤發(fā)生、新血管生成、免疫抑制TME重塑、癌癥化療抵抗、復發(fā)和轉移。TAMs可分為M1型和M2型，M1型TAMs通過表達趨化因子CCL20、趨化因子生長調節(jié)基因(C－X－C motif ligand，CXCL)10和CXCL11以及分泌干擾素和白細胞介素12募集、激活自然殺傷細胞和樹突狀細胞；此外，M1型TAMs通過分泌趨化因子CCL15等誘導激活 T 細胞，具有抗腫瘤作用。M2型TAMs表達趨化因子CCL17等能增加VEGF、IL－8、MMP、轉化生長因子和T細胞抑制分子的分泌，促進血管生成和細胞外基質重塑信號的表達，具有致瘤作用[7]。

由此可見，在乳腺癌原位瘤中，靶向TAM并介導其表型表達，可以有效影響腫瘤細胞轉移。已有研究發(fā)現(xiàn)顆粒前體蛋白聯(lián)合TAM衍生的外顯體能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移。為此，乳腺癌原位TME在治療乳腺癌轉移及評價藥物抗轉移療效實驗中不可或缺。

1.3.2乳腺癌血行轉移的特征性描述

腫瘤細胞通過血液循環(huán)向遠處擴散是乳腺癌患者轉移和復發(fā)的重要途徑，即血行轉移。原位癌細胞增殖過程中，腫瘤性血管生長，侵襲基底膜、穿入血管后在循環(huán)系統(tǒng)中存活，形成瘤栓并運行到靶器官，滯留于靶器官的微小血管中，然后穿出血管形成微小轉移灶。

癌細胞血行轉移成功的關鍵是其在血流中能否存活，因為大部分血流中癌細胞將被剪切力和免疫系統(tǒng)攻擊破壞，少于0.01%的癌細胞能夠轉移成功。目前的證據(jù)表明，在多種惡性腫瘤中都存在血小板數(shù)量增加和血小板活化現(xiàn)象，且這兩者變化與癌癥病情進展密切相關。腫瘤細胞自原發(fā)位置的脫落，誘導的血小板聚集在腫瘤細胞周圍，保護腫瘤細胞在循環(huán)中免于破壞、利于腫瘤細胞與血管內皮細胞的黏附及移出血管，保證腫瘤細胞在血管內可以存活[10]。且腫瘤血行轉移在癌癥發(fā)生早期便已存在，因此及時、有效地發(fā)現(xiàn)和干預循環(huán)腫瘤細胞的產生、阻斷血行轉移是減少乳腺癌遠處轉移、提高患者生存率和生存質量的關鍵。但在動物實驗過程中，單純向靜脈注射的腫瘤細胞模擬腫瘤血行并不能等同于腫瘤轉移細胞，其存在的差別會造成實驗結果可信度存疑。在抗腫瘤轉移相關動物模型中必須對此進行考慮。

1.3.3中醫(yī)藥調節(jié)乳腺癌腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境中細胞與分子不斷相互作用的現(xiàn)象，與中醫(yī)學“陰陽失衡”的理論存在共通之處：機體陰陽消長失去相對平衡，氣血、經絡、臟腑等相互關系失調，則疾病發(fā)生發(fā)展。從中醫(yī)角度認識腫瘤微環(huán)境，并利用中醫(yī)藥多成分、多效應的特點，干預調控乳腺癌腫瘤微環(huán)境，可為乳腺癌的治療提供新的思路。

臟腑虧虛、正氣不足為乳腺癌發(fā)病之本。從扶正固本入手，提高機體免疫功能、改善乳腺癌腫瘤微環(huán)境，可以發(fā)揮抗腫瘤作用。常用藥物如人參、白術、黃芪、靈 芝、黨參、當歸、白芍、淫羊藿等。細胞實驗及動物實驗均表明，人參皂苷 Rg3 可誘導巨噬細胞向M1極化，改善腫瘤微環(huán)境[11]。黃芪多糖與巨噬細胞在一個體外培養(yǎng)體系中共存，能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。

此外，瘀血阻于乳絡發(fā)為乳腺癌，故活血化瘀是治療乳腺癌的法則之一。活血化瘀類中藥如丹參、郁金、姜黃、莪術、雞血藤、川芎、三七等均為治療乳腺癌的常用藥物，主要機制是對腫瘤細胞的抑制、減少骨髓來源的抑制性細胞數(shù)量、抗腫瘤血管生成等[7]。對此，有必要充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，從辨證論治的角度深入研究中醫(yī)藥在乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的作用機制，并結合現(xiàn)代醫(yī)學治療方法，提高其在實際治療中的應用，使乳腺癌患者受益。

1.4 現(xiàn)有模型及不足

1.4.1現(xiàn)有原位腫瘤移植模型以皮下種植為主，以腋窩或腹股溝為主要部位，缺乏微環(huán)境特異性模擬，更缺乏臨床腫瘤治療原位手術結合術后化療的流程模擬。

1.4.2現(xiàn)有轉移路徑模型以尾靜脈單獨注射為主，雖能有效構建腫瘤入血后的轉移活性評價，但僅限于對腫瘤細胞轉移強度或位點的粗略分析，與腫瘤微環(huán)境組分的互作評價及腫瘤血液免疫微環(huán)境對循環(huán)系統(tǒng)腫瘤細胞的檢測模型和評價認為空白。本模型有效構建，能夠為活血化瘀中藥基于腫瘤血液微環(huán)境調節(jié)實現(xiàn)腫瘤轉移治療應用的藥效評價和機理解析提供有效的模型支撐。

1.5總結

基于上述分析和目前相關技術研究體系的不足，本規(guī)范擬強調腫瘤與微環(huán)境之間存在相互作用關系，在腫瘤轉移中重視原位腫瘤細胞與巨噬細胞、循環(huán)腫瘤細胞與血小板對腫瘤轉移全過程產生的重要影響，全方位真實模擬腫瘤的發(fā)生、轉移及臨床抗腫瘤治療流程，提高抗腫瘤轉移藥物的藥效評價可信度。

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