為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細胞中的功能，我們運用CRISPER/Cas9技術對斑馬魚npsn進行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經預測它們的蛋白結構相對于野生型斑馬魚出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導致了mRNA的全面降解所導致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細胞的發(fā)育，我們通過斑馬魚中性粒細胞特異性標記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號點的數(shù)量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽性細胞的數(shù)量也沒有差異。并且進一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因為Npsn只是斑馬魚中性粒細胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細胞功能的影響，而中性粒細胞的主要功能是參與機體的固有免疫反應，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實驗。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細胞在抵抗細菌感染中存在功能缺陷。為了進一步驗證Npsn在中性粒細胞抵抗感染中的作用，我們通過構建斑馬魚Npsn過表達的轉基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過表達后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個結果進一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細菌感染。

但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細胞抵抗感染的呢？先前有體外實驗證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細胞外基質的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗證這個觀點，我們觀察了在感染后4小時時傷口處中性粒細胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細胞的完整性，進而影響大腸桿菌在機體內存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細胞抵抗細菌感染的具體機制，還需要更多的實驗來驗證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應模型，對研究在感染過程中，中性粒細胞與病原菌的相互關系，以及對研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導意義。

動物模型的制備和應用實驗必須在具備相應資質的實驗室開展。動物模型的制備、應用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應符合國家相關法律規(guī)定。

1．npsnsmu5突變體中中性粒細胞的數(shù)量沒有明顯改變

為了驗證npsnsmu5突變體中npsn表達量的減少是由于每個中性粒細胞中npsn表達量下降，還是由于中性粒細胞的數(shù)量減少，我們利用斑馬魚整體原位雜交技術檢測中性粒細胞的其他標記物mpx和lyz的表達是否發(fā)生改變。結果表明，在npsnsmu5 突變體內lyz和mpx信號點并沒有明顯變化（如圖7 A, B, A’和B’所示），并且我們通過SB染色方法(主要染的中性粒細胞中脂質顆粒)，發(fā)現(xiàn)SB信號點的數(shù)量也沒有明顯變化（如圖7 C和C’所示）。在微分干涉顯微鏡（differential interference contrast microscope，DIC)下觀察中性粒細胞的顆粒，同樣沒有發(fā)現(xiàn)npsnsmu5 突變體與野生型斑馬魚有明顯的改變。以上結果表明，npsnsmu5突變體中中性粒細胞的數(shù)量沒有明顯改變。

圖7. npsnsmu5突變體中中性粒細胞的數(shù)量沒有明顯改變。

（A和A’）.lyz整體原位雜交和PBI區(qū)lyz+細胞數(shù)量統(tǒng)計。（B和B’）.mpx整體原位雜交和PBI區(qū)mpx+細胞數(shù)量統(tǒng)計。（C和C’）.SB染色和SB+信號點的統(tǒng)計。

2．npsn缺陷導致斑馬魚抵抗E.coli感染的能力下降。

中性粒細胞在抵抗細菌感染中起著不可或缺的作用。為了檢測斑馬魚在敲除npsn后是否影響斑馬魚抵抗細菌感染的能力。我們分別在野生型斑馬魚組和npsnsmu5突變體組分別在卵黃囊處感染大腸桿菌。為了摸索一個合適的大腸桿菌感染濃度，我們分別在野生型斑馬魚組打入10、100和1000 CFUs的菌落，發(fā)現(xiàn)10 CFUs菌就可以導致斑馬魚的感染死亡，并且隨著感染大腸桿菌菌量的增加，斑馬魚的死亡率逐漸升高，并且感染10和100 CFUs大腸桿菌時從2 dpi開始死亡，而感染1000 CFUs大腸桿菌時，第一天就會出現(xiàn)死亡（如圖8 A所示）。由于100 CFUs的大腸桿菌菌量能夠使野生型斑馬魚的存活率在40 %-60 %之間，因此100 CFUs的大腸桿菌菌量作為本研究所使用的感染菌量。當野生型斑馬魚和npsnsmu5突變體同時感染大腸桿菌后，在1 dpi所有的胚胎都正常存活，在2 - 3 dpi魚體開始出現(xiàn)死亡，并且npsnsmu5突變體的存活率比野生型對照組顯著下降，在4 - 5 dpi時，有些胚胎存活下來，同時也沒有出現(xiàn)明顯感染的表型，這說明大腸桿菌在這些胚胎內的生長成功被抑制（如圖8 B所示）。以上結果表明，npsn缺陷導致斑馬魚抵抗E.coli感染的能力下降。

圖8. npsn缺陷降低斑馬魚抵抗大腸桿菌感染。

A.野生型斑馬魚感染不同濃度的大腸桿菌后的生存曲線。B.野生型斑馬魚和npsnsmu5突變體斑馬魚

為了進一步確定Npsn在斑馬魚抵抗大腸桿菌感染中的作用，我們在npsn mRNA的起始轉錄點ATG附近設計了嗎啉代（morpholino）片段（npsn-ATG-morpholino），嗎啉代是一種被修飾過的可以抵抗核酸酶消化的反義寡核苷酸[88]，能夠行使干擾基因功能或者阻斷RNA翻譯的起始或者阻礙RNA的剪切。為了驗證npsn-ATG-morpholino是否可以干擾npsn基因翻譯的起始，我們首先體外合成了npsn-ATG-morpholino互補片段（complementation）（DNA模板片段如圖9 A所示），后面連接EGFP的序列的RNA片段，然后和npsn-ATG-morpholino一起通過顯微注射技術注射到斑馬魚單細胞的胚胎中，在熒光顯微鏡下觀察是否有綠色熒光出現(xiàn)。結果顯示，在注射npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFP的RNA序列的對照組，可以觀察到綠色熒光的表達，而注射npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFP和npsn-ATG-morpholino混合物組未出現(xiàn)綠色熒光的表達（如圖9 B所示），說明npsn-ATG-morpholino序列可以有效阻止npsn轉錄的起始。然后我們注射該morpholino片段和野生型斑馬魚同時感染大腸桿菌，結果顯示，相對于野生型斑馬魚，注射npsn-ATG-morpholino組斑馬魚的存活率顯著下降，這說明敲低斑馬魚npsn的表達，使斑馬魚抵抗大腸桿菌感染的能力下降（如圖9 C所示）,這與npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后的表型相似。以上結果進一步證明，斑馬魚npsn缺陷能夠導致斑馬魚抵抗大腸桿菌感染的能力下降。

圖9. 敲低npsn的表達使斑馬魚抵抗大腸桿菌的能力下降。

A.用于體外轉錄npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFPRNA的DNA片段的模式圖；B. npsn-ATG-morpholino的效率檢測；C. 野生型斑馬魚和注射npsn-ATG-morpholino斑馬魚同時感染大腸桿菌后的生存曲線。log-rank test，*** p＜0.001，n＞60。

3．npsn缺陷導致斑馬魚感染后體內殘余大腸桿菌量增加

我們檢測了大腸桿菌菌群在npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚體內增殖的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)在感染大腸桿菌后兩天，在npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中大腸桿菌的數(shù)量都有所上升，并且在大腸桿菌在npsnsmu5突變體中增殖的速度比較快，導致在1 dpi（days post infection）和2 dpi，npsnsmu5突變體斑馬魚體內殘留更多的大腸桿菌（如圖10所示）。這說明npsn缺陷影響了斑馬魚中性粒細胞有效控制大腸桿菌感染的能力，使大腸桿菌在體內繁殖的更快，進而引發(fā)了更嚴重的感染。

圖10. npsn缺陷導致斑馬魚感染后體內殘余大腸桿菌量增加。

4．npsn缺陷導致斑馬魚感染大腸桿菌后早期炎性因子水平顯著升高。

體內炎癥因子水平是判斷體內炎癥反應的重要指標之一，因此我們利用qRT-PCR技術，檢測了在大腸桿菌感染早期相關炎性因子和趨化因子的表達水平。il-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、tnf-α（Tumor Necrosis Factor a）和tnf-β（Tumor Necrosis Factor β）是重要的炎性因子，正常情況下在體內的表達量很低，在機體遭受到感染時，其表達量迅速上升。我們發(fā)現(xiàn)在早期感染中，il-1b、 tnf-a和tnf-β表達都顯著上升，并且npsnsmu5突變體中的表達水平比野生型斑馬魚顯著升高。il-8（interleukin-8, IL-8）是相對下游基因，并且對中性粒細胞的募集起著重要的作用。我們發(fā)現(xiàn)，il-8的表達量與il-1b、tnf-a和tnf-β表達趨勢一致，在npsnsmu5突變體中的表達量也比野生型對照組中顯著升高（如圖11所示）。以上結果表明，斑馬魚npsn缺陷可以導致斑馬魚體內的炎癥反應更為強烈。

圖11. npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌早期炎癥反應更為強烈。

5. npsn的過表達增強了針對大腸桿菌感染的宿主免疫反應

為了評估Npsn是否增強了E.coli的清除，我們將融合了6Myc標簽并由hsp啟動子驅動的Npsn編碼序列克隆到Tol2載體中（稱為作為pTol2-hsp-Myc-npsn）。將該構建體注射到單細胞階段的WT胚胎中，并通過抗Myc染色鑒定F0的后代。選擇F1Myct胚胎，并標記為Tg（hsp：Myc-npsn）品系。隨后將Tg（hsp：Myc-npsn）和WT胚胎感染大腸桿菌，并置于熱激條件下，然后記錄存活率。我們的發(fā)現(xiàn)表明，相對于WT變體，Tg（hsp：Mycnpsn）系表現(xiàn)出明顯更高的存活率（圖12），這表明npsn的過表達增強了斑馬魚胚胎中宿主對大腸桿菌感染的免疫反應。

圖12. 注射100 CFU的大腸桿菌后，Tg(hsp：Myc-npsn)和WT胚胎的存活曲線。

當我們測量與感染的胚胎的體內細菌生長相關的動力學曲線時，我們發(fā)現(xiàn)在1和2 dpi時，Tg(hsp：Myc-npsn)胚胎中的細菌負荷顯著低于野生型胚胎。數(shù)據(jù)顯示，大腸桿菌在npsn過表達的胚胎中增殖較慢，這表明npsn過表達可以增強宿主抵抗斑馬魚胚胎中大腸桿菌感染的防御能力.在Tg(hsp：Myc-npsn)胚胎中，炎癥因子（tnfa，il-8和il-1b）的表達低于野生型對照（圖13f），表明npsn過表達的胚胎中炎癥的減輕。此外，過表達npsn可以挽救npsnsmu5突變體胚胎中改變的炎癥反應（圖13g），這表明Npsn在宿主抵抗細菌的防御中很重要。

圖13. 炎癥因子（tnfa，il-8和il-1b）的表達

f. 2 hpi時Tg(hsp:Mycnpsn)胚胎中炎癥反應的變化。g. npsn過表達可挽救炎性細胞因子表達的改變

使用的品系：SD大鼠。制作方法：膠原誘導、佐劑。

1．中性粒細胞的形態(tài)及生化特征

原始中性粒細胞的發(fā)育首先由髓系祖細胞經譜系決定，發(fā)育成粒細胞前體細胞，再由粒細胞前體細胞經過增殖，分化和成熟形成有功能的中性粒細胞。在斑馬魚中，區(qū)分中性粒細胞可通過以下形態(tài)學與細胞學方法[1,2]：（1）成熟的中性粒細胞最顯著的形態(tài)學特征為含有分葉核以及大量顆粒的細胞質，可以在循環(huán)系統(tǒng)以及結締組織中被很清晰地辨認。（2）還可以通過分子標記來分辨不同成熟時期的中性粒細胞。已經有研究報道的粒細胞特異分子標記有轉錄因子C/ebp1，粒細胞顆粒中含有的髓過氧化物酶（Mpx）、溶菌酶C（Lyz）等。（3）另外，還可通過檢測細胞的激活、趨化、變形運動能力、及吞噬、殺菌作用來辨別。（4）此外中性粒細胞可被蘇丹黑B（Sudanblack B，SB）特異性染色，并且可根據(jù)染色程度來辨別不同分化過程的中性粒細胞。

2．中性粒細胞與病原菌感染

中性粒細胞是一種具有多形核的白細胞，是人體固有免疫中的重要組成成分，在機體抵抗病原菌感染時起著重要的作用。中性粒細胞在體內含量豐富，大約占人體白細胞總數(shù)的40%-75%[3]，并且在機體遭受病原菌感染時，中性粒細胞能夠迅速的從血管中遷移到感染部位[4]。當中性粒細胞到達感染處后，主要通過兩種方式來抵抗感染，一種是分泌大量的細胞因子和趨化因子，比如IL-1b[5], IL-18[6], LL-37[7] ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 等，這些小分子能夠招募和激活更多的中性粒細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞到達感染部位，共同抵抗感染。另一方面，中性粒細胞還能夠直接吞噬和消化病原菌，這主要依賴于斑馬魚中性粒細胞中含有豐富的顆粒酶。中性粒細胞內含有多種顆粒，這些顆粒富含各種殺菌作用的蛋白，并且在終末分化完成之前各種富含不同組分的顆粒必須組裝完成（如圖1所示）。中性粒細胞中三種顆粒分別是（1）嗜天青顆粒：又稱初級顆粒，在早幼粒細胞中數(shù)量最多，顆粒中含有髓過氧化物酶、溶菌酶及較多的水解酶。（2）特異顆粒：又稱次級顆粒，其中含有乳鐵蛋白、溶菌酶等，顆粒膜上有多種CD抗原和受體。（3）白明膠酶顆粒：含白明膠酶、溶菌酶[8]。這些顆粒主要通過兩種方式來殺滅病原菌。一種是氧依賴性殺菌途徑，主要通過激活膜結合成分NADPH系統(tǒng)，產生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）來直接氧化并殺死病原菌[9]；另一種方式是通過氧非依賴性方式來消化破壞病原菌的細胞膜或壁結構的完整性[10,11]，從而通過使病原菌失去滲透壓而死亡。但是目前對這些顆粒酶的研究大多數(shù)是在體外實驗進行的，大部分顆粒酶的體內功能是未知的。因此了解和研究這些顆粒酶的成分以及顆粒酶的功能有助于研發(fā)新的抗菌酶。

圖1. 中性粒細胞中所含的顆粒酶種類，引用自Borregaard 等[12]。

3．斑馬魚Npsn蛋白的簡介

Npsn最早在鯉魚（Cyprinus carpio）的淋系造血組織中發(fā)現(xiàn)，屬于蝦紅素蛋白家族（astacinfamily）的一員，并且具有肽鏈內切酶活性[13]。蝦紅素蛋白家族屬于金屬鋅蛋白酶超家族的一員，在蛋白質消化、個體背腹軸確定以及形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用[14]。研究者通過對比鯉魚的Npsn的蛋白序列與其他物種的同蛋白家族酶的相似性，發(fā)現(xiàn)Npsn與medaka的孵化酶有大于50%的序列相似性，但是作者并沒有在鯉魚的孵化液中檢測到Npsn的存在，所以作者猜測Npsn可能沒有孵化酶的活性。而關于Npsn的另一個研究是在斑馬魚中進行的，作者通過分析斑馬魚造血組織的ESTs序列以及整體原位雜交（Whole-mount In Situ Hybridization, WISH）實驗，發(fā)現(xiàn)了三個新的特異性表達在斑馬魚血管以及造血組織中的基因，Npsn就是其中的一個[15]。并且作者通過雙色原位雜交進一步發(fā)現(xiàn)Npsn可能表達在斑馬魚的中性粒細胞中。根據(jù)以上前人的研究，我們猜測，Npsn可能是斑馬魚中性粒細胞中的一種顆粒酶，然而 Npsn在中性粒細胞中的作用，以及是否參與到宿主先天免疫至今尚未有研究。

4．斑馬魚在作為研究中性粒細胞顆粒酶功能的模式生物中的優(yōu)越性

近幾十年來，斑馬魚逐漸成為一種強大的工具來研究感染類疾病，除了斑馬魚的傳統(tǒng)優(yōu)勢外，在研究中性粒細胞和病原菌的相互關系中具有獨特的優(yōu)勢。首先，斑馬魚中性粒細胞的發(fā)育過程是保守的，都是起源于造血干細胞，通過早幼粒、中幼粒最終發(fā)育成為成熟的帶有分頁核的粒細胞[12]。其次，斑馬魚中成熟的轉基因技術可以用熒光蛋白標記中性粒細胞，進而在活體實時觀察中性粒細胞對病原菌的響應以及吞噬病原菌的過程[16]。第三，利用微分干涉相差顯微鏡顯微鏡（DIC）可以清晰看到中性粒細胞所含的顆粒酶，以及顆粒酶的發(fā)育過程。

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